荧光显微镜的原理和操作步骤的介绍

荧光显微镜不是通过普通光源的照射来观察标本，而是利用一定波长的光（通常是紫外光、蓝紫光）在显微镜下激发标本中的荧光物质发出荧光，所以，荧光显微镜光源的作用不是直接照射，而是作为能量源激发标本内部的荧光物质。我们之所以能观察到标本，是由于光源的照射，而是标本中的荧光物质吸收激发光能后呈现的荧光现象。

荧光显微镜的原理是什么?

与普通光学显微镜不同，荧光显微镜不是通过普通光源的照射来观察标本，而是利用一定波长的光（通常是紫外光、蓝紫光）在显微镜下激发标本中的荧光物质发出荧光，所以，荧光显微镜光源的作用不是直接照射，而是作为能量源激发标本内部的荧光物质。我们之所以能观察到标本，是由于光源的照射，而是标本中的荧光物质吸收激发光能后呈现的荧光现象。

由此可见，荧光显微镜的主要特点是它的光源可以在特定波长范围内提供大量的激发光，使被测样品中的荧光物质能够获得被测物的激发光。必要的强度。同时，荧光显微镜必须有相应的滤光系统。

荧光显微镜是免疫荧光组织化学的重要工具。它由超高压光源、滤光系统（包括激发和加压滤板）、光学系统和照相系统等主要部件组成。它利用一定波长的光激发标本发射荧光。

激发荧光的方式：根据光的波长范围分为UV激发法（使用紫外照射法）和BV激发法（使用蓝紫光）。紫外激发法使用短于 400 nm 的近紫外光进行激发。该方法没有可见的激发光，因此观察到的荧光表现出染料的固有荧光，很容易区分标本上的特异性荧光和背景组织的自发荧光。

BV激发法是从紫外光激发到以404nm和434nm为中心的蓝光。这种方法使用蓝光照射标本，因此荧光观察系统的截止滤光片必须使用能够完全阻挡蓝光并完全通过所需的绿色和黄色荧光的滤光片。用于荧光抗体测定的荧光染料。激发光的Z大吸收波长与荧光的Z大发射波长比较接近，所以BV激发法中使用的滤光片必须使用锐截止滤光片。该方法可以使用蓝光作为激发光，因此荧光染料的吸收效率高，可以获得更亮的图像。缺点是500nm以下看不到荧光，500nm以上会使整个图像呈现黄色。在荧光抗体法中，大部分荧光染料都是独特的。因此，在讨论细微特异性时，上述 BV 激发方法的缺点往往影响很大。

综上所述，荧光显微镜的照明根据聚光镜的结构和激发光的波长可以分为以下三点。

1.从荧光图像的对比度要求来看，紫外激发的暗场聚光镜适合照明。

2.考虑到图像的亮度，BV激发滤光片的暗场观察效率高。

3.UV激发滤光片暗场观察和BV激发暗场聚光镜照明的特点可以说是介于这两种照明方式之间，但前者的滤光片暗场特性更强，显示的图像更亮，对比度小；后者保留了暗场光路的特性，因此显示图像更暗，对比度提高。实际使用荧光显微镜时，应使用适合标本要求的照明方法进行观察。

必须指出的是，即使是用对比度好的紫外激发暗场聚光器照射时，被试样折射或散射的部分紫外激发光也会进入物镜，使加胶面和光学玻璃中的加胶面光学系统会受到激发的影响，产生的自发荧光会使图像的响应变差。因此，必须在目镜前使用吸收紫外线的滤光片作为截止滤光片。